空间转录组第一讲：10x空间转录组技术介绍

最近，空间转录组学研究炙手可热。细胞及其在组织样本中的相对位置之间的关系对于理解疾病病理可能至关重要。空间转录组学是一项开创性的技术，它使科学家能够测量组织样本中的所有基因活性，并绘制出发生该活性的位置的图。该技术已经导致了新发现，这些新发现将有助于帮助科学家更好地了解生物过程和疾病。

来自10X公司的Visium空间基因表达解决方案，提供了分析空间整体转录组的方法。通过将总mRNA基因表达数据与形态H&E染色的图像相叠加，利用Visium，研究人员可以从整个组织切片和各种各样的样本类型中获得整个转录组高通量基因表达分析结果。该解决方案使研究人员能够揭示正常和患病组织的生物学结构，并发现新的组织生物标志物。

优势总结：
一、可以分析整个组织中的整个转录组，而不只被限定在有兴趣的某个小区域内。
二、visium提供高的细胞分辨率，每个斑点的直径为55微米。表示每个斑点上平均有1到10个细胞，细胞的数量根据组织样本的不同而略有差异。

三、可以从完整的组织获得完整的转录组基因表达，因此无需解离组织，没有组织解离偏向性。

四、可以结合临床病理信息，讲组织上的病理特征跟基因表达结合起来。

五、易于使用的分析软件结合了组织学基因表达数据，以简化数据分析。

原理图：

1、每个载玻片包含四个捕获区域，可以容纳四张单独的组织切片。
2、每张载玻片具有5000个条形码斑点的捕获区域。
3、每个斑点中包含数百万个含有聚（dT）的寡核苷酸链，可捕获带ployA的mRNA。

实验操作流程：

1、新鲜冰冻组织标本切片放置在载玻片的四个捕获区，每个区域一张切片。
2、利用标准的固定和染色技术（包括H＆E染色）在载玻片上对组织切片进行染色。
3、组织透化（也就是在细胞上打出小孔），从细胞中释放出mRNA，mRNA与spot上存在的空间条形码寡核苷酸结合。
4、反转录，合成cDNA的第二条链并变性。
5、带有barcoded的 cDNA被收集起来用于建库。
6、建好的文库再用测序仪进行测序。

组织透化优化：

组织透化优化是指在进行正式的实验之前先用组织透化芯片来做预实验，因为不同组织类型的结构蛋白不同，也导致组织透化所需时间不同，所以需要提前摸索组织透化的最优时间。

组织优化与一般建库步骤有两点不同：
① 反转录时使用的dNTP带Cy3荧光基团，用于评定组织透化程度；
② 成像之前需要去除组织，组织有自发荧光会干扰荧光成像。

最佳组织透化时间通过三个条件决定：
①荧光信号最强；
②荧光信号弥散最弱；
③前两个情况一致的情况下选择较长的组织透化时间。

数据分析：
得到测序数据之后就可以对空间转录组测序数据进行分析了。

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